瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)之凝膠制作與點(diǎn)樣

 

1、瓊脂糖凝膠濃度

 

   配制凝膠的濃度據(jù)實(shí)驗(yàn)需要而變 ，一般在0．8％ ～2．0％之間，如果一次配制凝膠100 ml，沒用完的凝膠可以再次融化，但隨著融化次數(shù)的增加，水分丟失也越多，凝膠濃度則會(huì)越來越高，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果不穩(wěn)定，補(bǔ)水辦法：一是在容器上標(biāo)記煮膠前的刻度，煮膠后補(bǔ)充相應(yīng)的水分至原刻度；二是在煮膠前稱重，煮膠后補(bǔ)充水至原重量。粗略一點(diǎn)的方法是通過多次較恒定的煮膠條件得出一個(gè)經(jīng)驗(yàn)補(bǔ)水值。以保證凝膠濃度基本維持在原濃度。核酸染色劑溴化乙錠(ethidium bromide)可加在融化的瓊脂糖中，終濃度為0．5 t*g／ml；也可在電泳結(jié)束后染色。

 

2、梳板的選用

 

   一般每個(gè)制膠模具均配有多個(gè)齒型不同的梳板，梳齒寬厚，形成的點(diǎn)樣孑L容積較大，用于DNA 片段回收實(shí)驗(yàn)等；相反，梳齒窄而薄，形成的點(diǎn)樣孑L容積就較小，用于PCR產(chǎn)物、酶切產(chǎn)物鑒定等。梳板的選擇主要是看上樣量的多少而定，一般來說，上樣量小時(shí)盡量選擇薄的梳板制膠，此時(shí)電泳條帶致密清晰，便于結(jié)果分析。另外，每次制膠時(shí)都要注意梳齒與底板的距離至少要1 mm，否則，拔梳板時(shí)易損壞凝膠孑L底層，導(dǎo)致點(diǎn)樣后樣品滲漏。當(dāng)然，點(diǎn)樣孑L的破壞還與拔梳板的時(shí)間和方法有關(guān)，一般凝膠需冷卻30 min以上方可拔梳板，應(yīng)急的情況下可以將成型的凝膠塊放4℃ 冰箱中冷卻15 min 左右，拔梳板的方法是將制膠槽放置在電泳槽中的電泳緩沖液中，然后垂直向上慢慢用力，因?yàn)橛幸后w的潤滑作用，梳板易拔出且不易損壞點(diǎn)樣孑L。

 

二、點(diǎn)樣

 

    點(diǎn)樣需加上樣緩沖液，因?yàn)樯蠘泳彌_液中加了甘油或蔗糖增加密度，使樣品沉入孑L底；指示樣品的遷移過程，上樣緩沖液中一般加了兩種指示劑，溴酚蘭和二甲苯青(值得注意的是指示劑并非染色劑，DNA染色劑是溴化乙錠，而且要在紫外光的激發(fā)下才能看見桔紅色熒光)。上樣緩沖液儲(chǔ)存液一般為6× (10×)，表示其濃度為工作濃度的六倍。使用時(shí)上樣緩沖液應(yīng)稀釋到一倍濃度。點(diǎn)樣方法是將移液器基本垂直點(diǎn)樣孑L，用另一只手幫助固定移液器下端，移液器槍頭(Tip)進(jìn)入點(diǎn)樣孑L即可將樣品注入孑L內(nèi)，千萬不可將Tip尖插至孑L底，并點(diǎn)上適合的DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，所謂適合是指樣品DNA分子量大小應(yīng)基本在DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)范圍之內(nèi)。